科研 | Microorganisms：比较基因组和生理分析揭示某细菌是生物肠道微生物群非典型脱氧胆酸的产生者

预培养出来一物展开接种。在48全程内测幅度了潮湿和胆汁酸产幅度。培养出来皿没有人展开缓冲，因为初步统计数据揭示，当共存几种经试验的有机缓冲液时，c-25的潮湿值得注意减少(统计数据仍未揭示)。因此，培养出来皿pH最小值的调节所致了短暂的初始pH最小值，由于二氧本土化碳和酸性寄生虫葡萄糖一物共同过渡到碳酸，初始pH最小值随着时长的很长缓慢减少。测定每种培养出来皿的初始和最终培养出来皿pH最小值，见备注S3。 在每个样本中会统计分析的胆汁酸是CA、DCA和7-oxo-DCA，因为这是在含CA的c-25培养出来一物对31种胆汁酸展开初始胆汁酸抽样时检测到的唯一胆汁酸(统计数据仍未揭示)。7-oxo-DCA由CA通过7α-羧酸甾体脱氢底物催本土化的可逆反应降解。因此，CA、DCA和7-oxo-DCA被解释为与CA葡萄糖关的的总胆汁酸定幅度关的池中。 据报道，仍未知的DCA采购者兼具并不大致相同层面的7α-去羧酸本土化技能，其中会C. scindens显出新出新特别极高的活性，比其他病症原体极略优于新有约100倍。我们的试验结果只不过与这些报道明确(布3a-h)。在pH最小值为7和8时，G10和ATCC 35704T的DCA回升平外速度，CA减少平外速度。在这两种pH必需下，CA的一般来说低水平在2-6 h内大幅度减少，相符股票价格从前期到股票价格中会期的潮湿过渡期。这种减少伴随着DCA的具体来说回升，DCA在胆汁酸池中的80-90%不远处趋于稳定。在DCA初始峰最小值后，7-oxo-DCA在胆汁液池中中会保持恒定的5-10%。虽然在pH为6和9的必需下也能掩蔽到潮湿和DCA的过渡到，但潮湿速率极高，CA到DCA的类比延迟。像是的是，G10在pH最小值为9时比pH最小值为6时更加利于DCA的过渡到，而ATCC 35704T则只不过。DCA的过渡到与细胞膜密度并非必然关的，pH最小值为6的两株C. scindens病症原体在潮湿现代高OD660必需下外显出新出新相当极高的DCA过渡到。总的来说，DCA和7-oxo-DCA的检测，以及CA的基本上完以外去除，证明了两株病症原体的7α-去羧酸本土化和7α-羟脱氢底物活性的很长。 在所有必需下，c-25培养出来一物的OD660外总体降高，其峰最小值为0.374，而G10和ATCC 35704T的OD660分别为1.310和1.133(布3i-l)。病症原体在pH最小值8时潮湿平外速度，OD660峰最小值最极高。在pH最小值为7和8的必需下，48 h内c-25胆汁酸产幅度揭示CA含幅度稳定减少，DCA和7-oxo-DCA含幅度具体来说回升。然而，转本土化率远远优于C. scindens病症原体，有约36 h 70-80%的CA底一物葡萄糖。在pH最小值为8的必需下，DCA降解幅度最极高，在36到48 h的孵育后，DCA的低水平继续回升近50%。最小或许注意的是，在pH最小值为7和8时，总胆汁酸池中中会7-oxo-DCA的比例也远远极优于C. scindens病症原体。这在pH最小值为7时特别值得注意，7-oxo-DCA低水平最多36 h的DCA。像是的是，在pH最小值为6时，没有人潮湿或CA类比的迹象。在pH为9时，虽然培养出来一物揭示出新值得注意的潮湿，但没有人掩蔽到DCA的显现出新，唯一的证据是12全程后胆汁酸转本土化为7-oxo-DCA。 在最适潮湿必需层面，C. scindens ATCC 35704T、C. scindens G10和Eubacterium sp. C. 25更加倾向于中会性必需，而不是弱碱性必需，即pH最小值为7和8。这些也是抑制DCA快速显现出新的必需。然而，DCA的显现出新者对7α-去羧酸CA的技能只不过与其潮湿和增殖技能是分开的。在pH最小值为6和9的G10和ATCC 35704T培养出来液中会(布3a,d,e,h)，细胞膜密度和DCA的显现出新并不确实关的，不太可能是由于底物活性的差别或抑制的bai遗传学隐含。这在c-25中会特别值得注意，在pH最小值为8时DCA的过渡到极优于pH最小值为7时，但在pH最小值为9时没有人检测到DCA，尽管掩蔽到适度的潮湿(布3j-l)。

布3 并不大致相同初始pH必需下，都有Eubacterium sp. c-25在内的DCA采购者的潮湿和胆汁酸产幅度的时长操作过程统计分析。试验病症原体为：(a-d) C. scindens ATCC 35704T， (e-h) C. scindens G10和(i-l) Eubacterium sp. c-25。潮湿用OD660(左至右)测定。胆汁酸的百分比是由胆汁酸的含量一般来说于CA(黑色骰子)、DCA(红色圆圈)和7-oxo-DCA(蓝色菱形)的总含量来计算的。计算出来新了三个独立试验的平外数。

3 以外遗传学组脱氧核糖核酸和病症原体检验

为了在借助遗传学组资讯展开发生学统计分析的基础上对c-25展开归入检验，我们与C. scindens G10一起未确定了c-25的以外遗传学组，该以外遗传学组也欠缺遗传学组资讯，可用做与c-25的遗传学组来得统计分析(备注2)。借助最初获的遗传学组统计数据，对c-25 16S rDNA展开BLASTn搜索，以寻觅短尾一亚种。像是的是，最接近的归一化是Lachnoclostridium phocaeense，一种从人类文明分泌物中会除去出新来的寄生虫，其明确性为97.2%。 虽然这从仍未优于建议的一亚种分成阈最小值~ 98-99%，但我们还展开了ANI统计分析，更加未确定北部分c-25和L. phocaeense(布4)。结果揭示，c-25的ANI最小值只有74.9%，远优于普遍接受的95%种内截断最小值，我们确信c-25与L. phocaeense不是同一种。此外，与备注1所列的其他DCA采购者远比，掩蔽到更加高的ANI最小值(64.65%至71.82%)，备注明至少在一亚种低水平上，c-25在它们间的发生学唯一性。C. scindens G10也显出新出新与其他DCA病症原体类似于的ANI最小值(64.66% ~ 73.75%)，但与C. scindens ATCC 35704T的归一化度为99.35%，证明其为C. scindens病症原体。 为了科学研究c-25的发生学和更加极一个大的归入，借助来自c-25 16S rDNA的从前29个BLASTn片段，以及来自其他DCA采购者（C. scindens ATCC 35704T、C. scindens G10和Peptacetobacter hiranonis）的16S rDNA，重构发生学果树(布5)。根据NCBI归入统计数据库系统，我们只设为了已建立联系或提议的种级归入旧名的病症原体。像是的是，C. hylemonae是唯一出新现在从前29片段中会DCA的采购者。该果树或许注意之后在科学研究中会断定的最初假定的DCA采购者：Sporofaciens musculi, Dorea sp. AM58-8, Dorea sp. AF36-15AT（备注1）。早先，从16S rDNA关连性来看，c-25与L. phocaeense的短尾最为密切，而在从前BLAST片段中会仍未检测到其他Lachnoclostridum病症原体，我们还回升了3株Lachnoclostridium病症原体，通过其与Lachnoclostridium分属其他成员的发生学距离来假设c-25是否分分属Lachnoclostridium分属：Lachnoclostridium edouardi Marseille-P3397 (NZ_OESQ01000006)、Lachnoclostridium pacaense Marseille-P3100 (NZ_LS999944)和Lachnoclostridium phytofermentans ISDg (NC_010001)。因此，共有39株病症原体被设为发生学果树(布5)。 结果备注明，Eubacterium sp. c-25与L. phocaeense短尾最为密切，与其他仍未知DCA显现出新孢子如C. scindens、C. hylemonae和P. hironis有较远的距离。然而，出新乎意料的是，其他近亲分属并不都有额外的Lachnoclostridium一亚种，而是在Eubacteriales一个科地Drancourtella分属, Massilistercora分属和Mordella分属。此外，其他Lachnoclostridium一亚种也不有数在一起，因为被意味著来自同一分属成员。这些结果备注明，Eubacterium sp. c-25不太可能是Eubacteriales一个科中会的一员，但由于Lachnoclostridium分属的归入地位不明确，在科和分属低水平上无法展开恰当的归入。为了获c-25的可靠归入资讯，必需对其归入学展开重最初审查，并对都有L. phocaeense在内的归入单元旧名展开有效地发备注。

备注1 用做生一物资讯学统计分析的病症原体的遗传学组资讯。

1 IMG归入单元的ID。

备注2 完整的遗传学组资讯。

布4 Eubacterium sp. c-25、L. phocaeense和其他与DCA显现出新关的的病症原体间的ANI热布。应用做备注1所列病症原体展开ANI统计分析。通过OAT降解热布，并在原始输出新的基础上展开极高分辨率重构。

布5 Eubacterium sp. c-25及其关的孢子(都有仍未知DCA显现出新孢子)的最小似然发生学果树。重构果树的病症原体都有29个与Eubacterium sp. c-25最接近的16S rDNABLASTn(不都有仍未培养出来和仍未识别的病症原体)归一化，以及另外10个人工去除的病症原体：L. phocaeense Marseille-P3177, C. scindens G10, C. scindens ATCC 35704T, P. hiranonis DSM 13275, S. musculi WCA-9-b2, Dorea sp. AF36-15AT, Dorea sp.AM 58-8, Lachnoclostridium edouardi Marseille-P3397 (NZ_OESQ01000006), Lachnoclostridium pacaense Marseille-P3100 (NZ_LS999944)和Lachnoclostridium phytofermentans ISDg344 (NC_010001)。本科学研究中会用做生一物资讯学统计分析的病症原体被加粗。果树是在MEGA X中会应用做Tamura-Nei三维重构的，有1000个bootstrap，并在中会点生根。bootstrap大力支持最小值列在见下文的旁边。

4 bai遗传学的检验

以外遗传学组共同点遗传学的归入从c-25和其他DCA采购者应用做OrthoFinder允许断定了一组遗传学，在c-25 (EUBC25_24880-EUBC25_24960, EUBC25_02220)和G10 (CSCING10_002180 CSCING10_002270)，被假设为C. scindens ATCC 35704T 共同点的bai遗传学(S1必要元数据)。假设的c-25 Bai亚基与C. scindens ATCC 35704T的亚基关连性高得惊人，但BaiH亚基除外(布6)。当地BLASTp搜索证明，c-25遗传学组区块的其他亚基质与C. scindens ATCC 35704T Bai亚基的关连性大于OrthoFinder断定的亚基质，这大力支持了它们作为bai遗传学共同点一物的假设。 假定的c-25 bai遗传学的遗传学左至右与C. scindens有更加大差别(布7)。与C.scindens的整个bai遗传学簇由单个组蛋白依靠并显现出新单个多顺反子mRNA并不大致相同，只不过c-25的bai遗传学被除去成多个遗传学簇，这些遗传学簇不太可能来自并不大致相同的组蛋白核苷酸(组蛋白假设资讯见备注S4)。在c-25中会，baiA2BGF和baiCDE分别构成一个遗传学簇，而baiH和baiI与其他bai遗传学不共享一个组蛋白。假设胆汁酸催本土化反应器件(barA, barB)被确信参与激活催本土化反应的遗传学被断定在baiA2BGF集群的上游。此外，baiI位于一个单独的染色体周边北部，游走其他的bai遗传学。重要的是，在c-25中会没有人断定baiG共同点一物。只不过，在baiB下游共存一个与C. scindens BaiG依赖型类似于的MFS依赖型遗传学，但其核苷酸明确性极高(22%，E-value 0.013, BLASTp)。我们假定这种十分类似于baiG的运亚基是baiG的备注征共同点一物。 对C. scindens G10的遗传学组也展开了同样的统计分析。这些统计分析断定了一个与C. scindens ATCC 35704T基本上大致相同的bai丝氨酸形态(遗传学左至右与布1b大致相同，bai亚基的核苷酸有约100%大致相同)，与意味著的同一一亚种成员大致相同。结果证明了C.scindens G10在DCA产幅度和其7α-去羧酸本土化技能的遗传学组基础上外分分属传统的7α-去羧酸本土化一亚种。

布1 bai亚基质和bai遗传学参与了CA过渡到DCA的操作过程。(a)Funabashi等人科学研究了C. scindens VPI 12708中会CA和 DCA的7α-去羧酸本土化操作过程，都有bai亚基质和中会间副产一物。(b)科学研究了C. scindens VPI 12708和ATCC 35704T中会bai丝氨酸的左至右。bai亚基在bai丝氨酸中会由它们各自的遗传学展开颜块。

布6 仍未知和最初检验的bai遗传学核苷酸识别热布备注，假定的DCA采购者。c-25最接近的猿类种为L. phocaeense。借助BLASTp统计分析(a) C. scindens ATCC 35704T和(b) Eubacterium sp. c-25参考bai遗传学作为搜索，分析报告核苷酸的共同点性(%)。BLAST努力最小值(E-values)在备注中会计算出来新。较暗的方格备注示较极高层面的明确。ND =仍未检测到。bai遗传学标识资讯见备注S1。

布7 在C. scindens G10, Eubacterium sp. c-25, Dorea sp. AF36-15AT, Dorea sp. AM58-8和S. musculi中会掩蔽到的bai遗传学左至右。共享遗传学(或假设的特性同系一物在baiG的从前提)是彩块的。

5 CA共存下bai遗传学的隐含统计分析

由于成功地在Eubacterium sp. c-25中会检验出新了bai候选遗传学，我们借助baiB、baiCD和baiH的抗体核苷酸展开了qRT-PCR统计分析。本统计分析的一个科地是通过检测CA在C. scinden中会的抑制隐含低水平来验证假定的bai遗传学的身份，并将每个遗传学的隐含低水平与C. scindens G10中会的隐含低水平展开来得。最小或许注意的是，在CA缺失的从前提，C. scindens ATCC 35704T中会的bai遗传学在基础低水平上被激活，而且可以下调到更加高的隐含低水平。我们下半年baiB、baiCD和baiH的一般来说遗传学隐含低水平在G10中会是类似于的，在G10中会它们是从单个组蛋白核苷酸激活的，而在c-25中会它们的大致相同遗传学隐含低水平则揭示更加多的差别。为了让这些bai遗传学是因为它们代备注了c-25中会三个主要的bai遗传学簇，并且也被报道为7α-去羧酸本土化所确实的。此外，baiB是C. sciindens bai丝氨酸中会第一个激活的遗传学，baiH是紧接著第二个激活的遗传学，覆盖了整个bai丝氨酸。 qRT-PCR结果揭示，在CA共存的从前提，G10中会baiB、baiCD和baiH的bai遗传学隐含分别回升了67.3倍、29.8倍和16.6倍(布8a和备注S5)。在c-25中会，这些遗传学的隐含回升了218.8、291.8和13.9倍(布8b和备注S6)，备注明假设的bai遗传学共同点一物在c-25中会是备注征bai遗传学。然而，bai遗传学在c-25中会的隐含低水平有相当大的差别，baiB和baiCD的隐含低水平大有约是baiH的15倍20倍。在G10中会，bai遗传学隐含低水平一般来说类似于，并且如意味著的那样，在丝氨酸中会按下游顺序减少。

布8 qRT-PCR结果揭示，去除或不去除CA时，baiB、baiCD和baiH遗传学的隐含。隐含测幅度(a)C. scindens G10 (n = 3)和(b)Eubacterium sp. c-25 (n = 7)。细胞膜在调节pH最小值为8的GAM 中会培养出来，在共存(CA)或不共存(对照)0.1 mM CA的从前提采集并在股票价格中会期潮湿过渡期展开总RNA浓缩。计算出来新了每个遗传学一般来说于参考管家遗传学recA的隐含低水平的平外数。误差棒备注示平外数的标准误差。p最小值优于0.05被确信是总体的，并在面板中会用则有备注示(*:p ＜0.05， **: p＜0.01，***: p＜0.001)。

6 7α-去羧酸寄生虫的检验

早先，我们寻觅其他不太可能兼具与c-25类似于的bai遗传学形态和左至右的寄生虫。由于在c-25中会断定Bai亚基与传统DCA采购者有更加大的并不大致相同，我们应用做c-25中会的BaiB展开了质生一物亚基BLAST搜索。通过对除去病症原体和脱氧核糖核酸病症原体展开抽样，断定3株病症原体与c-25 BaiB遗传学类似于度为74-77%：Sporofaciens musculi、Dorea sp. AF36-15AT和Dorea sp. AM58-8。各品系外证明共存其他bai遗传学。这三种病症原体的bai遗传学左至右与c-25基本上大致相同(布7)，只是在S. musculi中会，在baiA2-F丝氨酸的下游端额外区块了一个依赖型遗传学，baiI遗传学位于baiH的下游。在c-25中会断定的像baiG的运亚基也在这三个最初的候选病症原体中会类似所在位置断定(布7)。

讨论

本科学研究明确了新颖但被遗忘的次级胆汁酸显现出新孢子Eubacterium sp. c-25的形体、潮湿、胆汁酸葡萄糖和遗传学组资讯。长久以来，仍未知小肠DCA显现出新者的名单之从前之外少数几种一亚种，在几十年的科学研究中会，基本上没有人断定最初的除去一物。此外，现有的DCA过渡到三维主要基于C. scindens科学研究采集的统计数据。而人类文明排泄一物除去Eubacterium sp. c-25已被证明能显现出新DCA，但在本科学研究中会获的认知和遗传学组统计数据单打独斗了现过渡期DCA采购者的认识，揭示了其新颖的形体(布2)，依赖于特定的pH最小值最佳潮湿必需和7α-去羧酸本土化(布3)，以及一种最初的bai遗传学左至右，这不太可能代备注了DCA显现出新者中会完以外仍未被追寻的遗传学型，其共存多个发生学上遥远的小肠/排泄一物除去株:S. musculi、Dorea sp. AF36-15AT和Dorea sp. AM58-8(布6和7)。

在其他DCA采购中会仍未掩蔽到c-25的网状形体。C. scindens、P. hiranonis和C.hylemonae的布像揭示它们兼具类似于的杆状大小，但任何可见的端到端相互连接仅限两个或三个细胞膜单链。在各种小肠寄生虫中会都可以掩蔽到网状形体，都有糖类和双歧细孢子，但对于网状芽孢的报道很少，因为它们主要是不相连的。这大幅度大力支持了我们的断定，即c-25在发生学上并不大致相同于仍未知的DCA采购者。

16S rDNA发生学统计分析结果备注明，从归入上看，c-25分分属Eubacteriales一个科(布5)。然而，由于其在在猿类一亚种L. phocaeense的归入命名共存疑虑，现有Lachnoclostridium归入提案中会，并不需要恰当归入c-25。

从布3中会可以看出新，都有c-25在内的所有被试病症原体的潮湿和DCA的显现出新在更加大层面上依赖于培养出来皿的pH。一个利于胃潮湿和7α-去羧酸本土化的pH范围内不太可能或许了胃小肠环境中会的定殖偏好。C. scindens只不过很难在较粗的pH范围内内增殖，而c-25不太可能之外中会性或质碱性环境。窄的pH范围内不太可能利于该病症原体在c-25范围内内潮湿，限制该病症原体向兼具较极高pH最小值的特定群体或胃小肠均匀分布的潮湿。例如，尽管并不大致相同科学研究的结果和试验方法并不大致相同，但只不过有一个普遍的共识，即近端小肠pH最小值范围内有约5.8-6.7大概，在启动时小肠和直肠中会则回升到6.1-7.5。克罗恩病症（Crohn’s disease）和溃疡性小肠炎患者的胃小肠pH最小值也出新现升极高。虽然c-25在人类文明小肠中会的流行率尚不清楚，但有不太可能该病症原体占据了一个特定的生态平衡位，如启动时小肠，或者在线状的认知必需下大幅度共存，所致小肠pH最小值回升，这备注明pH最小值不太可能被用作与DCA产幅度回升关的的疾病症正常的标识。近年来，虽然认知pH最小值与定殖间的联系尚仍未得到专门科学研究，但借助纳米级二次原子质谱和恒免疫学统计分析对接种的C. scindens在灵生小鼠三维中会的定位抗体定殖展开了科学研究。为了大幅度科学研究c-25和其他DCA采购者的生态平衡位，有确实扩展这些先进的核心技术，并专门针对小肠pH随所在位置和群体的很长展开科学研究。

长久以来，7α-去羧酸本土化的必需是抑制baiA2-I遗传学簇，该遗传学簇由单个组蛋白依靠并显现出新单个多顺反子mRNA。虽然在在发备注的一项恒遗传学组组装遗传学组统计分析断定，bai遗传学簇的并不大致相同左至右与C. scindens中会断定的左至右并不大致相同，但还没有人病症原体被试验显然很难显现出新DCA。在c-25中会断定了新颖左至右但兼具值得注意特性的bai遗传学簇，以及它在其他寄生虫中会的共存，必需重最初安全检查DCA采购者的多样性和7α-去羧酸本土化的遗传学基础。如布8示意图，c-25在CA共存时，baiB和baiCD的隐含总体回升，远比之下，CA抑制的baiH隐含幅度回升不大。这种不成比例的抑制与c-25 bai遗传学被分成多个单独激活的遗传学簇的事实相明确，但提出批评新了bai遗传学隐含在c-25中会如何协作和催本土化反应的疑虑。这些极高隐含bai遗传学的认知和葡萄糖因素必需大幅度科学研究，这不太可能有助于深入了解因素DCA在胃小肠环境中会过渡到的因素所。

通过对c-25和C. scindens的bai遗传学的来得统计分析，提出批评新了其特性和完好的几个疑虑。首先，虽然我们假定像BaiG亚基是胆酸运亚基BaiG的备注征共同点一物，但这还有待试验证明。由于它与C. scindens的BaiG亚基只有22%的核苷酸大致相同，因此在亚基质形态和生一物特性上不太可能共存较大差别。其次，baiI被确信区块了7β-脱水底物，参与酸(兼具7β-羧酸的CA的外大分子)的7β-去羧酸本土变作DCA，在先从前统计分析的DCA显现出新一物的bai丝氨酸中会断定，该遗传学并没有人与c-25中会的其他bai遗传学或两个Dorea种与c-25有着大致相同bai遗传学左至右。由于baiI本来从仍未被显然在胃对7α-去羧酸本土化没有人确实，有不太可能只有当底一物兼具7β-羧酸时，baiI在c-25和两种Dorea一亚种中会才有差别隐含。第三，与其他bai遗传学远比，c-25和C.scindens中会的baiH兼具很极高的关连性(布6)，说明它在7α-去羧酸本土化操作过程中会兼具重要作用，是一种不可替代的亚基。在在的一项科学研究备注明，在恒遗传学组统计数据集检验的共同点遗传学中会，baiH及其共同点遗传学baiCD的亚基质只不过比其他bai遗传学保守层面更加极高，但在本科学研究中会，c-25的baiCD明确性不极高。c-25中会其余的白族遗传学外显出新出新高亚基质关连性，共同点率有约为50%(布6)。由于7α-去羧酸本土化底物级联的每一步都必需多样的生本土化修饰，我们努力DCA采购者兼具更加极高层面的bai遗传学守恒。然而，在c-25和C.scindens间掩蔽到的高亚基质关连性，以及不太可能由并不大致相同的遗传学特意所致的并不大致相同低水平的差别隐含，备注明DCA采购者间的遗传学型变异性不太可能比早先意味著的更加多。

在Eubacterium c-25中会断定的新颖的bai遗传学左至右在其他寄生虫(如S. musculis 和 Dorea spp.)中会断定，这一掩蔽有力地显然了小肠DCA显现出新者中会共存替代bai遗传学型。大规模恒遗传学组统计推断，bai遗传学在小肠质生一物群落中会比早先确信的更加常见，这就提出批评新了一个疑虑，即除了在此之从前断定的少数DCA采购者都有，还对其实际数幅度和多样性提出批评新了质疑。

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